El ADN mitocondrial, al igual que los ADN bacterianos, es una molécula bicatenaria, circular, cerrada, sin extremos. En los seres humanos tiene un tamaño de 16.569 pares de bases, conteniendo un pequeño número de genes, distribuidos entre la cadena H (de mayor densidad) y la cadena L (de densidad ligera).
El número de genes en el ADN mitocondrial es de 37. Codifica para dos ARN ribosómicos, 22 ARN de transferencia y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa. El cromosoma mitocondrial se organiza en "nucleoides", de tamaño variable y de unos 0,068 nanómetros de tamaño en humanos, y formados por entre 5-7 cromosomas y algunas proteínas.
El ADN mitocondrial está en replicación constante, independientementemente del ciclo y del tipo celular. Se piensa que tiene lugar en las dos cadenas en tiempos diferentes y con dos direcciones contrarias. En primer lugar, se inicia la replicación o síntesis de la nueva Hélice L, sin que se comience la replicación de la nueva hélice pesada. Una vez iniciada la replicación de la nueva hélice L, la síntesis es unidireccional y avanza desplazando a la otra hebra. Cuando se ha sintetizado, aproximadamente, 2/3 de la nueva hélice ligera, comienza la síntesis de la nueva hélice H, en una sola dirección opuesta a la de síntesis de la hélice L.
El ADN mitocondrial está sometido a un importante estrés por su proximidad con los centros de producción de radicales libres de oxígeno, de forma que disponen de una varia y compleja maquinaria de reparación.
Una característica muy interesante es que, en las mitocondrias, el código genético está ligeramente alterado: UGA, que sería el codón de terminación, lo leen como triptófano las mitocondrias de mamíferos, hongos y protozoos., pero es una señal de "stop" en plantas; el codón AGG, que normalmente codifica arginina, codifica "parada" en mitocondrias de mamíferos y serina en las de Drosophila.
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